Прорыв в исследованиях CRISPR может привести к более эффективному и безопасному редактированию генов

 

10 лет назад мы стали свидетелями прорыва в современной биологии.

Американский ученый обнаружил, что манипуляции с белком Cas9 привели к созданию генной технологии, достойной научно-фантастического фильма: CRISPR.

Думайте об этом как о паре молекулярных ножниц, способных разрезать и редактировать ДНК людей, животных, растений, бактерий и вирусов.

Потенциал огромен и охватывает все, от устранения наследственных заболеваний до производства культур, способных противостоять изменению климата.

 

Однако, как и у любой другой новой технологии, у CRISPR были свои проблемы. Одна из главных задач заключалась в том, чтобы сделать технологию максимально эффективной и убедиться, что ножницы режут только там, где мы хотим.

"Мы описали новые механизмы, лежащие в основе CRISPR"

Два новых исследования Копенгагенского университета, проведенные совместно с исследователями из Орхусского университета, могут помочь решить эти проблемы.

"Мы описали новые механизмы, лежащие в основе CRISPR", - говорит профессор биоинформатики Ян Городкин с кафедры ветеринарии и наук о животных.

"Теперь мы можем объяснить, почему некоторые нецелевые, то есть непреднамеренные сокращения в других частях генома, более эффективны, чем целевые, то есть сокращения в намеченном месте. Мы также узнали, как различные последовательности ДНК вокруг мишени могут влиять на то, насколько эффективно белок Cas9 разрезает ДНК. Надеемся, что эти знания проложат путь к более эффективному и безопасному использованию CRISPR".

Итак, как же работает CRISPR? Сначала ученый сконструирует фрагмент синтетической РНК, называемый направляющей РНК. Затем он присоединяется к белку Cas9, который будет выполнять задачу разрезания ДНК. Направляющая РНК ищет соответствующую секцию ДНК. Как только направляющая РНК найдет нужное место, Cas9 перережет нить ДНК. Теперь ученый может вставить любой синтетический фрагмент ДНК в освободившееся место.

Если Cas9 и направляющая РНК попадают в цель, ученые называют это попаданием в цель; если они попадают в другое место, они не попадают в цель.

Сегодня CRISPR в контексте медицины в основном используется для изучения того, как гены и лекарства работают в лаборатории, и до сих пор не получил широкого применения в лечении людей. Однако в долгосрочной перспективе идея состоит в том, чтобы использовать CRISPR для лечения определенных генетических заболеваний.

Разгадана тайна эффективного поражения не по целям

В одном из двух новых исследований исследователи стремились определить наилучший способ прикрепления направляющей РНК к ДНК, чтобы сделать срез как можно более эффективным — потому что, если срез недостаточно эффективен, ученые не смогут редактировать ДНК.

"Мы уже знаем, что CRISPR на самом деле не работает, когда связь между направляющей РНК и ДНК слишком слаба. Теперь мы узнали, что слишком сильная связь тоже проблематична", - говорит Городкин. "В обоих случаях генные ножницы слишком слабы и неэффективны".

Затем исследователи определили интервал, в котором связь между направляющей РНК и ДНК не является ни слишком сильной, ни слишком слабой, но в самый раз, в результате чего получаются ножницы с идеальной остротой.

"Интересно, что это наблюдение также может быть использовано для объяснения того, почему некоторые нецелевые объекты демонстрируют более сильную активность CRISPR, чем предполагаемые целевые объекты - то есть почему ножницы острее для некоторых нецелевых объектов, чем для целевых объектов", - объясняет Городкин.

"Это происходит потому, что слишком сильные воздействия на мишени не попадают в правильный интервал энергии связи. Но если вы удалите часть энергии из этих сильных связей, что и происходит в нецелевых участках, вы сможете правильно попасть в интервал, что приведет к более мощному эффекту и, следовательно, к более точному удару ножницами по нецелевым участкам".

Исследование также выявило оптимальное положение белка Cas9 для достижения наиболее эффективного среза.

Прежде чем Cas9 сможет разрезать ДНК, белок должен связаться с определенной частью цепочки ДНК. ДНК состоит из четырех различных нуклеотидов: A, C, G и T, и Cas9 может связываться только с последовательностью с двумя последовательными G-нуклеотидами.

Теперь исследователи определили влияние на Cas9 нескольких последовательных G—нуклеотидов - ситуация, когда трудно попасть в цель, потому что каждые два последовательных G конкурируют за связывание с Cas9.

"Когда есть несколько G "вверх по течению", то есть перед последовательностью, с которой предполагалось связать Cas9, сокращение будет более эффективным. Но когда есть несколько G "ниже по потоку", то есть после предполагаемой последовательности, с которой должен связываться Cas9, сокращение менее эффективно", - объясняет постдок Джулия Корси.

Корси надеется, что новые знания о том, как работает CRISPR, облегчат определение правильного положения Cas9 в будущем. Это также должно помочь свести к минимуму количество потенциальных побочных эффектов.

"Мы хотели бы иметь возможность прогнозировать сокращение, улучшать редактирование мишеней и устранять нецелевые эффекты, которые усложняют разработку новых лекарств, требуя много ресурсов, и могут привести к побочным эффектам, возникающим при удалении неправильного гена", - говорит Корси.

Нецелевые действия могут быть вредными — и они недостаточно изучены

Второе исследование сосредоточено на нецелевых показателях. Здесь исследователи разработали метод измерения эффективности нецелевых действий.

Чтобы контролировать качество эксперимента CRISPR, ученые обычно выбирают для тестирования меньшее количество нецелевых объектов, предсказанных компьютером. Однако, используя новую технологию, они смогут протестировать гораздо большее количество нецелевых препаратов, и ожидается, что это ускорит разработку новых лекарств с меньшим количеством побочных эффектов.

Используя новый метод, исследователи протестировали 8000 потенциальных мишеней для 110 направляющих РНК CRISPR в процессе трансляции в медицину человека. Они обнаружили, что около 10 процентов из 8000 потенциальных нецелевых целей на самом деле были нецелевыми.

"Мы обнаружили гораздо больше отклонений от намеченных целей, чем смогли бы сделать с помощью существующих методов", - объясняет Городкин.

Кроме того, 37 из этих нецелевых объектов расположены в генах, связанных с раком, что увеличивает риск того, что разработка лекарств станет сложнее или даже невозможной. Кроме того, непреднамеренные сокращения в этих генах могут даже привести к раку в качестве возможного побочного эффекта.

"Исследователи должны быть в состоянии идентифицировать такие нецелевые РНК и выбирать другие направляющие РНК, у которых нет этих или каких-либо других критических нецелевых РНК", - говорит Городкин.

Большая потребность в дополнительных исследованиях нецелевых

По словам Городкина, это показывает, что существует большая потребность в дополнительных исследованиях нецелевых объектов.

"Я бы сказал — и некоторые могут не согласиться, — что нецелевые цели крайне недостаточно изучены. У меня сложилось впечатление, что в существующих исследованиях по редактированию генов часто не хватает полных инструментов и анализов, необходимых для того, чтобы показать, что в их исследованиях нет побочных эффектов", - говорит он.

По словам Яна Городкина, новый метод окажет большое влияние в будущем, чтобы лучше проверять исследования на предмет нецелевых результатов.

"За последние 10 лет мы сделали большой шаг к тому, чтобы иметь возможность редактировать геном. Сейчас мы находимся в процессе совершенствования наших методов, повышения их безопасности и эффективности. Последнее также поддерживает зеленый переход, поскольку модификации генома, например, клеток, используемых в производстве, могут привести к более экономичному использованию ресурсов".

Эти два исследования опубликованы в журнале Nature Communications.

Категория: Наука и Техника | Добавил: fantast (30.10.2022)
Просмотров: 21 | Рейтинг: 0.0/0