Новая методика позволяет легко картировать генетические сети с помощью CRISPR

 

CRISPR-Cas9 позволяет легко выбить или настроить один ген, чтобы определить его влияние на организм или клетку, или даже на другой ген. Но что, если бы вы могли провести несколько тысяч экспериментов одновременно, используя CRISPR, чтобы настроить каждый ген в геноме индивидуально и быстро увидеть влияние каждого?

 

Команда ученых Калифорнийского университета в Беркли разработала простой способ сделать именно это, позволив любому человеку составить профиль клетки, в том числе клетки человека, и быстро определить все последовательности ДНК в геноме, которые регулируют экспрессию определенного гена.

 

В то время как метод в основном принесет пользу исследователям, которые заинтересованы в отслеживании каскада генетической активности—генетической сети—которая влияет на ген, который их интересует, он также поможет исследователям быстро найти регуляторные последовательности, которые контролируют гены болезни, и, возможно, найти новые мишени для лекарств.

 

"Болезнь, в которой вы можете использовать этот подход, - это рак, где мы знаем определенные гены, которые эти раковые клетки экспрессируют и должны экспрессировать, чтобы выжить и расти", - сказал Николас Инголия, адъюнкт-профессор молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли. "То, что этот инструмент позволит вам сделать, это задать вопрос: Что такое восходящие гены, какие регуляторы контролируют те гены, о которых мы знаем?"

 

Эти регуляторы могут быть легче нацелены терапевтически, чтобы отключить раковые клетки.

 

Новый метод упрощает то, что до сих пор было трудно сделать: вернуться назад по генетическим путям в клетке, чтобы найти эти конечные регуляторы.

"У нас есть много хороших способов работать вперед", - сказал он. "Это хороший способ работать в обратном направлении, выясняя, что находится выше чего-то. Я думаю, что он имеет много потенциальных применений в исследованиях болезней."

 

"Я иногда использую аналогию, что когда мы входим в темную комнату и щелкаем выключателем, мы можем видеть, какой свет включается. Этот свет подобен Гену, и мы можем сказать, когда щелкаем выключателем, какие гены он включает. У нас это уже очень хорошо получается", - добавил он. "То, что это позволяет нам сделать, это работать в обратном направлении. Если у нас есть свет, о котором мы заботимся, мы хотим выяснить, какие переключатели управляют им. Это дает нам возможность сделать это."

 

Райан Мюллер, аспирант лаборатории Ingolia, и его коллеги Лукас Фергюсон и Зурия Мичем вместе с Ingolia опубликуют подробности своей методики в интернете 10 декабря в журнале Science.

 

Штрих-кодирование генома

 

С тех пор как восемь лет назад появился метод редактирования генов CRISPR-Cas9, исследователи, которые хотят определить функцию конкретного гена, смогли точно нацелить его на белок Cas9 и выбить его. Руководствуясь частью направляющей РНК, комплементарной ДНК в гене, белок Cas9 связывается с геном и сокращает или, как в случае CRISPR-интерференции (CRISPRi), ингибирует его.

 

При самом грубом типе анализа клетка или организм либо живет, либо умирает. Тем не менее, можно искать более тонкие эффекты нокаута, такие как включение или выключение определенного гена или его увеличение или уменьшение.

 

Сегодня для этого требуется добавить репортерный ген—часто тот, который кодирует зеленый флуоресцентный белок,—прикрепленный к идентичной копии промотора, который инициирует экспрессию интересующего вас гена. Поскольку уникальный промотор каждого гена определяет, когда этот ген экспрессируется, если нокаут Cas9 влияет на экспрессию интересующего вас гена, он также повлияет на экспрессию репортера, заставляя культуру светиться зеленым под флуоресцентным светом.

 

Тем не менее, имея 6000 генов в дрожжах—и 20 000 генов в людях—это большое предприятие, чтобы настроить каждый ген и обнаружить эффект на флуоресцентном репортере.

 

"CRISPR позволяет легко всесторонне исследовать все гены в геноме и возмущать их, но тогда большой вопрос заключается в том, как вы считываете эффекты каждого из этих возмущений?" - сказал он.

 

Этот новый метод, который Инголия называет CRISPR-интерференцией с секвенированием репортера штрихкодированных экспрессий, или CiBER-seq, решает эту проблему, позволяя проводить эти эксперименты одновременно, объединяя десятки тысяч экспериментов CRISPR. Этот метод устраняет флуоресценцию и использует глубокое секвенирование для непосредственного измерения повышенной или пониженной активности генов в пуле. Глубокое секвенирование использует высокопроизводительную технологию секвенирования следующего поколения с длительным чтением для секвенирования и, по существу, подсчета всех генов, экспрессированных в Объединенных образцах.

 

"В одном объединенном эксперименте CiBER-seq за один день мы можем найти все вышестоящие регуляторы для нескольких различных генов-мишеней, тогда как если бы вы использовали метод, основанный на флуоресценции, каждая из этих мишеней заняла бы у вас несколько дней времени измерения",-сказала Инголия.

 

CRISPR каждого гена в организме параллельно является простым, благодаря компаниям, которые продают готовые, одиночные направляющие РНК для использования с белком Cas9. Исследователи могут заказать сгрнк для каждого гена в геноме, а для каждого гена-дюжину различных сгрнк—большинство генов представляют собой цепочки из тысяч нуклеотидов, в то время как длина сгрнк составляет около 20 нуклеотидов.

 

Ключевая инновация команды состояла в том, чтобы связать каждую сгрнк с уникальной случайной нуклеотидной последовательностью—по сути, штрих—кодом-соединенной с промотором, который будет транскрибировать штрих-код только в том случае, если ген, представляющий интерес, также включен. Каждый штрих-код сообщает об эффекте одной сгрнк, индивидуально нацеливаясь на один ген из сложного пула тысяч сгрнк. Глубокое секвенирование говорит вам об относительном содержании каждого штрих-кода в образце-для дрожжей около 60 000-что позволяет быстро оценить, какой из 6000 генов в дрожжах оказывает влияние на промотор и, таким образом, экспрессию интересующего гена. Для человеческих клеток исследователь может ввести более 200 000 различных направляющих РНК, нацеливаясь на каждый ген несколько раз.

 

"Это действительно суть того, что мы смогли сделать по—другому: идея о том, что у вас есть большая библиотека различных направляющих РНК, каждая из которых будет возмущать другой ген, но у нее есть один и тот же промотор запроса-ответ, который вы изучаете. Этот промоутер запросов расшифровывает случайный штрих-код, который мы связываем с каждым гидом", - сказал он. "Если есть ответ, который вас волнует, вы тыкаете в каждый отдельный ген в геноме и видите, как меняется ответ."

 

Если вы получаете один штрих-код, который в 10 раз более распространен, чем любой другой, например, это говорит вам, что этот промотор запроса включен в 10 раз сильнее в этой ячейке. На практике Инголия прикрепляла к каждой направляющей РНК около четырех различных штрихкодов в качестве четырехкратной проверки результатов.

 

"Глядя более непосредственно на реакцию экспрессии генов, мы можем уловить много тонкостей в самой физиологии, что происходит внутри клетки", - сказал он.

 

В недавно опубликованных экспериментах команда исследовала пять отдельных генов дрожжей, включая гены, участвующие в метаболизме, делении клеток и реакции клеток на стресс. В то время как при Криспринге всего генома можно изучать до 100 генов одновременно, он подозревает, что для удобства исследователи ограничились бы четырьмя или пятью одновременно.

ИСТОЧНИК

Категория: Наука и Техника | Добавил: fantast (11.12.2020)
Просмотров: 44 | Рейтинг: 0.0/0